藥品無菌檢查中污染微生物的鑒定

藥品出現(xiàn)質(zhì)量問題，不僅關(guān)系著藥品生產(chǎn)企業(yè)健康經(jīng)營發(fā)展，對患者生命安全也有著直接影響。近些年來，由微生物污染引發(fā)的藥害事件高頻率發(fā)生。微生物污染源來自各個方面，若藥品生產(chǎn)期間****工作未到位，則會提升藥品被微生物污染的幾率。若患者使用被污染后的藥品，其生命安全將受到一定威脅。基于此，文章就藥品無菌檢查中鑒定污染微生物展開研究。

藥品無菌檢查中污染微生物

鑒定必要性分析

無菌制劑用藥安全與前期藥品無菌檢查工作質(zhì)量有著十分密切關(guān)聯(lián)性，同時也直接影響著無菌制劑質(zhì)量評控水平以及****反應(yīng)情況的出現(xiàn)概率。通過對近些年來藥品無菌檢查實際情況的調(diào)研與分析，發(fā)現(xiàn)無菌藥害事件發(fā)生頻率逐漸提升。

但由于藥品質(zhì)量安全監(jiān)管各項工作精準(zhǔn)落實，使得無菌藥害事件所造成的負(fù)面影響并沒有擴大，這其中藥品無菌檢查在此過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。無菌藥品污染主要來自三個方面，分別是物理性污染、化學(xué)性污染以及微生物污染。其中導(dǎo)致微生物污染問題出現(xiàn)的成因較多，微生物污染是指在各種因素綜合作用影響下，使得無菌藥品中微生物含量超過國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，繼而發(fā)生微生物污染情況。

微生物具有體積小、生長繁殖快、種類多以及適應(yīng)強等特征，這在一定程度上加大了藥品無菌檢查難度，同時對此方面工作提出嚴(yán)格要求。目前國家現(xiàn)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關(guān)條例對藥品中微生物限量有著明確規(guī)定，要求通過開展藥品無菌檢查工作，對微生物限量進(jìn)行監(jiān)管，盡可能消除對無菌制劑對用藥者生命安全的威脅。

從現(xiàn)階段我國**用藥情況來看，用藥頻率逐年呈上升趨勢，在一定程度上加大了藥品質(zhì)量安全監(jiān)管難度。為了充分發(fā)揮藥品無菌檢查功能作用，必須做好污染微生物鑒定工作并確認(rèn)藥品無菌檢查過程中是否會對藥品帶來污染影響。以明確微生物污染源，為進(jìn)一步優(yōu)化與完善優(yōu)化藥品無菌檢查提供有價值參考依據(jù)。

污染微生物鑒定實驗

2.1.實驗準(zhǔn)備

污染微生物鑒定的實驗準(zhǔn)備流程如下：

(1)實驗研究對象：革蘭式陽性球菌，數(shù)量為 7 株；

(2)實驗要求：分別在兩個無菌且獨立的實驗室環(huán)境條件下開展污染微生物鑒定試驗，根據(jù)本次實驗具體要求，配置相應(yīng)數(shù)量實驗人員，要求參與實驗的人員均要獨自完成鑒定無菌藥品的實驗任務(wù)；

(3)基于國家現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，對產(chǎn)地、批次均不同的**進(jìn)行無菌檢查；改良馬丁培養(yǎng)基與硫乙醇酸鹽為培養(yǎng)基樣品，且存在處于生長狀態(tài)的微生物，培養(yǎng)時間設(shè)置為 24 h，環(huán)境溫度設(shè)置為 35 ℃，本次實驗期間**總計收集 7 株；

(4)將 7 株**微生物作為本次污染微生物鑒定實驗研究對象，通過一系列鑒定與分析，確定微生物污染源。

2.2.實驗方法

本 次 鑒 定 細(xì) 菌 微 生 物 過 程 中，選 擇 細(xì) 菌 基 因組 DNA 提取試劑盒輔助實驗人員提取微生物基因組 DNA，在提前準(zhǔn)備好的 TE 緩沖液中存放所提取的** DNA。

為滿足藥品無菌檢查中污染物微生物鑒定要求，將選擇三種鑒定方法，分別是全自動微生物生化鑒定、16SrRNA 基因測序鑒定方法以及RiboPrinter 儀器鑒定，這三種鑒定方法主要負(fù)責(zé)**鑒定，其中 Ribo Printer 儀器分型法、16SrRNA 基因同源分型法以及 DiversiLab 儀器分型法用于分析各菌株同源性[1]。另外，為了保證本次鑒定實驗結(jié)果準(zhǔn)確性，要求參與鑒定實驗的人員均要具備較高專業(yè)水平和豐富的實驗經(jīng)驗，確保**鑒定與分型實驗操作規(guī)范性、標(biāo)準(zhǔn)性，從而將微生物污染源如實反映。

2.3.實驗結(jié)果分析

2.3.1 **鑒定結(jié)果

本次鑒定實驗共選擇 7 株 細(xì) 菌，其 中 全 自 動微生物化鑒定、16SrRNA 基因測序鑒定方法以及RiboPrinter 儀器鑒定三種方法所顯示的 6 株**鑒定結(jié)果信息一致，表皮葡萄球菌為實驗室環(huán)境中的**。經(jīng)過一系列鑒定操作，樣品鑒定結(jié)果呈陽性，分別是表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌 ( 呈奶白色狀 )、溶血葡萄球菌。

2.3.2 **同源性鑒定結(jié)果

鑒定與分析**同源性的過程中，實驗人員采用了多種鑒定法。采用 Ribo Printer 儀器對**分型后，發(fā)現(xiàn)溶血葡萄球菌分型無明顯變化特征，沃氏葡萄球菌與表皮葡萄球菌分別存在 2 種和 3 種結(jié)果。

采用 16SrRNA 基因同源分型，發(fā)現(xiàn)在基因水平方面，溶血葡萄球菌和沃氏葡萄球菌二者之間差異性變化較小，表皮葡萄球菌結(jié)果存在 2 種。通過對比此鑒定方法下**同源性結(jié)果，基于參照的 16SrRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)結(jié)果信息顯示僅存在基因突變 1 個。

采用 DiversiLab 儀器分型，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌分別存在 2 組、3 組、2 組。通過分析葡萄球菌污染源，各實驗樣品中并未出現(xiàn)**交叉污染情況，但其中一項樣品被沃氏葡萄球菌污染的幾率較高；因此環(huán)境因素并不是表皮葡萄球菌污染源，與自身因素有著十分密切的關(guān)聯(lián)性。

2.4.實驗結(jié)果討論

從藥品質(zhì)量安全監(jiān)管角度上分析，藥品無菌檢查工作有效性開展，不僅有利于促進(jìn)藥品質(zhì)量提升，在一定程度上也能起到減少**用藥階段誘發(fā)**反應(yīng)情況出現(xiàn)，是實現(xiàn)藥品質(zhì)量安全監(jiān)管落實的必要途徑。通過對目前藥品無菌檢查情況調(diào)研與分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有污染微生物鑒定方法較為多樣，如全自動微生物生化鑒定方法、16SrRNA 基因測序鑒定方法等。其中生化鑒定法是現(xiàn)階段污染微生物鑒定過程中使用頻率較高的方法，但環(huán)境因素對此鑒定方法的使用效果有著較大影響，故該方法不適用于在過于復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行污染微生物鑒定[2]。

基于此，本次藥品無菌檢查中選擇多種鑒定方法輔助實驗開展。從整體上看，每項鑒定方法均獲得了較為精準(zhǔn)的結(jié)果，雖然各鑒定方法在操作方面各不相同，但其結(jié)果信息顯示均無明顯差異。通過對照上述幾種鑒定方法所顯示的結(jié)果信息，發(fā)現(xiàn) 6SrRNA 基因測序鑒定方法在分析菌株層面方面存在明顯劣勢，難以保證菌株層面分辨率。

因 RiboPrinter 儀器由高精密度構(gòu)件組成，在較高自動化水平支持下，使得鑒定結(jié)果相較于其他鑒定方法所提供的鑒定結(jié)果其結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性明顯高于后者。從藥品無菌檢查中微生物污染源追溯鑒定情況來看，溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌均為諸多污染源中較為常見的幾種類型。

就本次實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：污染樣品的來源為溶血葡萄球菌，通過觀察各實驗樣品，并未出現(xiàn)樣品間交叉污染情況；來源不同的沃氏葡萄球菌會對污染期間的樣品帶來一定程度上感染影響；上述提及表皮葡萄球菌來自所在環(huán)境，但環(huán)境因素并未對樣品造成污染。為了進(jìn)一步驗證藥品檢查中污染微生物鑒定結(jié)果是否與實驗過程中操作不規(guī)范相關(guān)，將采用 OOS( 超標(biāo)結(jié)果 )調(diào)查方法進(jìn)行驗證，檢查藥品整個無菌檢查流程。

基于國家現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)與 GMP 要求，具體要求如下：

(1) 實驗期間，所有參與實驗鑒定的人員均具備相應(yīng)專業(yè)資質(zhì)，對藥品無菌檢驗流程熟悉程度較高，各實驗環(huán)節(jié)均嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作；

(2) 實驗全過程所涉及到的儀器設(shè)備各項參數(shù)設(shè)置均未出現(xiàn)誤差，并無故障問題，符合污染微生物鑒定實驗要求標(biāo)準(zhǔn)；

(3) 實驗期間所涉及到樣品、培養(yǎng)基、沖洗液等，在實驗前期均做好相應(yīng)****工序，與無菌性實驗結(jié)果信息顯示一致；

(4) 針對環(huán)境中微生物檢測，僅收集到表皮葡萄球菌，其他相關(guān)環(huán)境微生物并未發(fā)現(xiàn)[3]。從 OOS 調(diào)查結(jié)果來看，藥品無菌檢查中來自實驗室檢驗期間污染的可能性*低。并加上多種鑒定方法反復(fù)對照實驗，可以確定藥品無菌檢查中微生物污染和實驗室環(huán)境因素不相關(guān)，其中樣品運輸或樣品加工環(huán)節(jié)受到污染的概率較高。因此，后期藥品無菌檢查過程中，相關(guān)人員應(yīng)多關(guān)注藥品加工及運輸環(huán)節(jié)，提升對微生物污染控制重視程度，積極應(yīng)用*新技術(shù)手段，為藥品無菌檢查工作高效率開展提供強力技術(shù)支持，從根本上保障藥品質(zhì)量安全。

加強藥品無菌檢查中微生物

污染控制的有效建議

上述提及到藥品無菌檢查中微生物污染與實驗室環(huán)境不相關(guān)，但藥品加工及運輸環(huán)節(jié)導(dǎo)致微生物污染問題發(fā)生的概率較高。基于此，下面將著重闡述對這兩方面加強監(jiān)管的措施，減少微生物污染情況出現(xiàn)。

1

人員方面

據(jù)數(shù)據(jù)顯示，由于人員操作方面因素導(dǎo)致無菌藥品中微生物含量超標(biāo)的概率*高，高達(dá) 70% 左右。為了進(jìn)一步加強對人員操作方面管控，應(yīng)根據(jù)國家現(xiàn)行規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，明確制定無菌操作流程，并要求進(jìn)入操作室的任何人員均要進(jìn)行****，并對無菌操作區(qū)內(nèi)的人員數(shù)量加以控制，一方面減少無菌操作區(qū)運動頻率，規(guī)范人員操作行為，防止污染源出現(xiàn)；另一方面針對非加工人員進(jìn)入無菌操作區(qū)，如：參觀人員、設(shè)備維修人員以及質(zhì)檢人員等，均要在專業(yè)人員監(jiān)督與指導(dǎo)下進(jìn)入無菌操作區(qū)，待做好**程序后，方可進(jìn)入無菌操作區(qū)，降低此方面出現(xiàn)微生物污染可能性。

除此之外，無菌操作是降低微生物污染概率的必要途徑，若藥品生產(chǎn)人員無菌操作意識薄弱、無菌操作不規(guī)范以及個人**不徹底等均會導(dǎo)致微生物污染情況出現(xiàn)。因此，必須提升藥品生產(chǎn)人員無菌操作規(guī)范性，增強無菌操作意識，在生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)嚴(yán)格按照規(guī)范流程進(jìn)行無菌操作，進(jìn)出無菌操作區(qū)均要**，切忌大幅度運動，防止人員運動帶來大量灰塵而導(dǎo)致微生物增多的情況出現(xiàn)。

2設(shè)施方面

為符合國家藥品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)的無菌藥品生產(chǎn)前提，需要保證藥品生產(chǎn)環(huán)境無菌。針對無菌環(huán)境設(shè)計，需要注意以下幾點內(nèi)容：

**，嚴(yán)格區(qū)分無菌和有菌區(qū)域，藥品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)所涉及到**設(shè)備均要按照規(guī)定要求并在指定區(qū)域內(nèi)存放和運輸。縮短藥品生產(chǎn)運輸路線，盡可能減少微生物出現(xiàn)。

**，做好無菌環(huán)境**工作。基于國家現(xiàn)行規(guī)定*新標(biāo)準(zhǔn)，選擇符合規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的**工藝，如甲醛熏蒸、乳酸熏蒸等，為了更好地保證藥品生產(chǎn)加工環(huán)境無菌性，應(yīng)根據(jù)實際生產(chǎn)情況，明確**效果*佳**工藝，切實做到無菌化藥品生產(chǎn)和加工[4]。

第三，無菌設(shè)備選擇。以**過濾設(shè)備為例，為了保證藥液在過濾過程中無微生物污染情況出現(xiàn)，應(yīng)按照 GMP 規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，選擇合適的無菌過濾設(shè)備，在過濾設(shè)備中添加雙層**濾芯，以此來達(dá)到有效**目的，從根源上規(guī)避濾芯破損而出現(xiàn)微生物污染問題。

第四，藥品運輸。全過程監(jiān)管藥品運輸，有利于確保藥品質(zhì)量安全，并符合國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。在實際藥品運輸過程中，應(yīng)遵循及時、準(zhǔn)確、安全以及規(guī)避微生物污染基本原則，嚴(yán)格按照現(xiàn)有藥品運輸管理制度體系開展藥品運輸各項工作。明確藥品運輸人員、藥品質(zhì)量管理人員責(zé)任范疇，在藥品運輸前期，根據(jù)藥品運輸各項要求，做好運輸路線規(guī)劃與運輸工具確認(rèn)工作。避免藥品運輸過程中出現(xiàn)不必要停留，有效縮短藥品運輸耗時。并確認(rèn)所運輸?shù)乃幤肥欠翊嬖诎b破損等情況，降低微生物污染概率。

除此之外，需要完善藥品運輸防護(hù)措施，如：防水、防潮、防蟲等相關(guān)措施，以預(yù)防與控制微生物污染。如運輸特殊品，應(yīng)按照國家相關(guān)規(guī)定執(zhí)行藥品運輸各流程，以提高藥品運輸質(zhì)量為原則，根據(jù)季節(jié)變化采取相應(yīng)保暖與冷藏措施，規(guī)避運輸環(huán)境因素導(dǎo)致微生物污染問題發(fā)生，切實做到全過程、全方位監(jiān)管藥品加工與運輸。

3結(jié)語

綜上所述，污染微生物鑒定作為藥品無菌檢查過程中*為關(guān)鍵一環(huán)，通過對其的研究以調(diào)研和分析目前藥品無菌檢查情況，其中為了保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性，采用了多種不同鑒定方法。結(jié)果顯示藥品被微生物污染，與環(huán)境因素?zé)o關(guān)，其中來自藥品加工或運輸階段的污染源概率較大。因此，為了降低藥品被微生物污染風(fēng)險，應(yīng)重點加強對此方面管控，減少藥品使用**反應(yīng)出現(xiàn)，從根本上保障藥品質(zhì)量。